利妥昔單抗(Rituximab，商品名美羅華)是治療B細(xì)胞淋巴瘤、自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)的關(guān)鍵藥物，其血藥濃度與療效及毒性密切相關(guān)。利妥昔ELISA試劑盒通過(guò)特異性抗原-抗體反應(yīng)定量檢測(cè)樣本(如血清、血漿)中的藥物濃度，為臨床用藥調(diào)整提供依據(jù)。以下是該試劑盒從樣本處理到結(jié)果判讀的完整操作流程。
 

　　一、樣本處理：從采集到預(yù)處理的規(guī)范操作
 

　　1.樣本采集：根據(jù)檢測(cè)目的選擇樣本類型——血清(常規(guī)監(jiān)測(cè))：靜脈采血后不抗凝，靜置30-60分鐘待血液凝固，以1500-2000rpm離心10-15分鐘，取上層透明血清；血漿(特殊需求)：采用EDTA或肝素抗凝管采血，離心條件相同(避免使用草酸鹽抗凝劑，防止干擾檢測(cè))。采血過(guò)程需規(guī)范(止血帶使用≤1分鐘，避免溶血或脂血)。
 

　　2.樣本預(yù)處理：離心后小心吸取上層清液(避免觸碰下層細(xì)胞殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶/DNA酶的離心管。若樣本預(yù)期濃度過(guò)高(如接近試劑盒檢測(cè)上限)，用配套稀釋液(通常為PBS緩沖液，pH7.2-7.4)進(jìn)行梯度稀釋(如1:10、1:100)，充分混勻(渦旋10-15秒)。脂血或黃疸樣本需通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾(驗(yàn)證不影響抗體活性)，預(yù)處理后的樣本4℃短期保存(≤3天)，長(zhǎng)期保存需-20℃(≤1個(gè)月)或-80℃(≤6個(gè)月)，且避免反復(fù)凍融(≤3次)。
 

　　二、檢測(cè)流程：從加樣到信號(hào)讀取的標(biāo)準(zhǔn)化步驟
 

　　1.試劑準(zhǔn)備：將試劑盒中的微孔板(包被利妥昔單抗捕獲抗體)、標(biāo)準(zhǔn)品(已知濃度的利妥昔溶液)、檢測(cè)抗體(酶標(biāo)記，如HRP)、底物溶液、洗滌液等平衡至室溫(20-25℃，30分鐘)。標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書(shū)梯度稀釋(如0、1、5、10、20、50μg/mL)，建立濃度梯度參考。
 

　　2.加樣與孵育：按順序向微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品(每孔100μL)、待測(cè)樣本(每孔100μL，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔)，37℃孵育60-90分鐘(或4℃過(guò)夜)，使利妥昔與包被抗體結(jié)合。孵育后甩干孔內(nèi)液體(輕拍或低速離心)，用洗滌液(含0.05%Tween-20的PBS)洗滌3-5次(每次浸泡1-2分鐘，避免殘留物干擾結(jié)合)。
 

　　3.酶標(biāo)抗體結(jié)合：加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體(每孔100μL)，37℃孵育30-60分鐘，形成“包被抗體-利妥昔-檢測(cè)抗體”復(fù)合物；再次洗滌5次。

 

　　4.顯色與終止：加入底物溶液(如TMB，避光反應(yīng)10-15分鐘)，利妥昔濃度越高，顯色越深(顏色強(qiáng)度與濃度成正比)；較后加入終止液(如1M硫酸)，終止反應(yīng)并穩(wěn)定顏色(溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色)。
 

　　5.結(jié)果讀?。河妹笜?biāo)儀在450nm波長(zhǎng)(參比波長(zhǎng)630nm校正背景)讀取各孔吸光度值(OD值)，確保儀器波長(zhǎng)校準(zhǔn)準(zhǔn)確(誤差≤±2nm)。
 

　　三、結(jié)果判讀：從數(shù)據(jù)到臨床意義的轉(zhuǎn)化
 

　　1.標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合：通過(guò)配套軟件(或手動(dòng)計(jì)算)將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(x軸)與對(duì)應(yīng)OD值(y軸)擬合為標(biāo)準(zhǔn)曲線(通常為四參數(shù)Logistic曲線，R²≥0.99)，確保曲線線性范圍覆蓋待測(cè)樣本濃度區(qū)間。
 

　　2.樣本濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算待測(cè)樣本的利妥昔濃度(單位：μg/mL或ng/mL)，取復(fù)孔平均值(偏差>10%時(shí)需重復(fù)檢測(cè))。
 

　　3.臨床解讀：結(jié)合患者治療方案判讀結(jié)果——例如，治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤時(shí)，利妥昔的血藥濃度在治療第15天應(yīng)達(dá)到30-100μg/mL(有效治療窗)，低于30μg/mL可能提示療效不足(需調(diào)整劑量或延長(zhǎng)輸注時(shí)間)，高于100μg/mL則可能增加輸液反應(yīng)或感染風(fēng)險(xiǎn)(需減量)。
 

　　利妥昔ELISA試劑盒的操作全流程是“樣本處理規(guī)范性+檢測(cè)流程標(biāo)準(zhǔn)化+結(jié)果判讀臨床化”的有機(jī)統(tǒng)一。通過(guò)嚴(yán)格遵循每一步操作要求，可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性與臨床指導(dǎo)價(jià)值，為利妥昔的個(gè)體化用藥與療效監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)保障。